Ernesto Guevara de la Serna yang dilahirkan di Rosario, Argentina, [3] ialah anak sulung antara lima adik-beradik di dalam sebuah keluarga berketurunan campuran Sepanyol, Basque, dan Ireland. Tarikh lahirnya direkodkan dalam sijil kelahiran sebagai 14 Jun 1928, walaupun sesetengah sumber menyatakan bahawa beliau sebenarnya lahir pada 14 Mei tahun tersebut. [4]

Salah satu moyang Guevara, Patrick Lynch, dilahirkan di Galway, Ireland pada tahun 1715, dan kemudian berpindah ke Bilbao, Sepanyol dan dari situ, menjelajah ke Argentina. Francisco Lynch (moyang Guevara) dilahirkan pada tahun 1817, dan Ana Lynch (neneknya) pada tahun 1861. Anaknya, Ernesto Guevara Lynch (bapa Guevara) pula dilahirkan pada tahun 1900. Guevara Lynch mengahwini Celia de la Serna y Llosa pada tahun 1927, dan mereka mempunyai tiga orang anak lelaki dan dua anak perempuan.

Berasal daripada sebuah keluarga kelas atas yang cenderung berhaluan kiri, Guevara telah dibimbing supaya mempunyai personaliti yang dinamik serta perspektif yang radikal sejak dari kecil lagi. Walaupun menghidapi penyakit lelah yang menjejaskan kehidupannya, beliau telah berjaya sebagai seorang olahragawan. Guevara juga pernah menjadi pemain ragbi di sebalik kecacatannya dan mendapat gelaran "Fuser" — singkatan untuk gabungan kata, "El Furibundo" (bahasa Inggeris: raging) dan "Serna", nama keluarga ibunya — kerana gaya bermainnya yang agresif. [5]

Guevara belajar permainan catur daripada bapanya dan mula melibatkan diri dalam pertandingan-pertandingan tempatan sejak berumur 12 tahun. [6] Semasa keremajaannya, beliau minat akan puisi, terutamanya oleh Pablo Neruda. Guevara, sebagaimana yang biasa dilakukan oleh orang Amerika Latin dalam golongannya, turut menulis puisi pada sepanjang hayatnya. Beliau sangat gemar membaca, dengan minat yang berbeza-beza antara pengembaraan klasik oleh Jack London dan Jules Verne sehingga rencana-rencana mengenai keseksualan oleh Sigmund Freud serta falsafah masyarakat oleh Bertrand Russell. Pada akhir keremajaannya, Guevara membentuk minat mendalam dalam seni foto dan menghabiskan banyak masa untuk mengambil gambar orang, tempat, dan semasa pengembaraannya yang kemudian, tapak arkeologi.

Pada tahun 1948, Guevara menyertai Universiti Buenos Aires untuk mempelajari bidang perubatan dan selepas beberapa gangguan, menghabiskan pembelajarannya pada bulan Mac 1953. Walaupun demikian, beliau tidak menjalankan latihan klinikalnya yang diperlukan untuk menjalankan praktik kedoktoran. Oleh itu, beliau merupakan seorang "médico" yang bukannya "doctor en medicina."

Sebagai pelajar, Guevara menghabiskan banyak masa untuk mengembara mengelilingi Amerika Latin. Pada tahun 1951, Alberto Granado, rakannya yang seorang ahli biokimia, mencadangkan agar Guevara bercuti setahun daripada kursus perubatannya supaya mengembara di Amerika Selatan, sebagaimana yang telah dibincangkan selama bertahun-tahun. Guevara dan Granado yang berusia 29 tahun ketika itu berlepas dari bandar asal mereka di Alta Gracia dengan menunggang motosikal Norton 500 cc 1939 yang dinamai mereka sebagai La Poderosa II (bahasa Inggeris: "the Mighty One, the Second"). Mereka merancang untuk menghabiskan beberapa minggu membuat kerja sukarela di perkampungan pesakit kusta San Pablo di Peru yang terletak di kawasan pinggir Sungai Amazon. Guevara mengisahkan pengembaraannya dalam karya  Diari-dairi Motosikal yang telah diterjemahkan ke dalam bahasa Inggeris pada tahun 1996 dan dijadikan sebuah filem dengan nama yang sama pada tahun 2004.

Menyaksikan kemiskinan, penindasan dan ketiadaan hak mengundi di seluruh Amerika Latin serta dipengaruhi oleh buku-buku Marxisme, Guevara memutuskan bahawa satu-satunya cara untuk mengatasi ketaksamaan wilayah itu ialah melalui pemberontakan bersenjata. Perjalanan dan pembacaannya telah menyebabkan Guevara berpendirian bahawa Amerika Latin bukannya sekumpulan negara yang berasingan tetapi sebuah entiti tunggal yang memerlukan suatu strategi kebenuaan untuk pembebasannya. Tanggapannya terhadap sebuah Ibero-Amerika bersatu tanpa sempadan yang berkongsi kebudayaan 'mestizo' merupakan suatu tema berulangan yang ketara pada tempoh-tempoh kegiatan pemberontakannya yang kemudian. Sebaik sahaja Guevara pulang ke Argentina, beliau mempercepatkan penyiapan kursus perubatannya supaya dapat menyambung semula perjalanannya di Amerika Selatan dan Amerika Tengah. Beliau menerima diplomanya pada 12 Jun 1953.